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酯功能化的雙子表麵活性劑與血紅蛋白的結合——材料和方法

來源:上海糖心视频在线播放官网 瀏覽 231 次 發布時間:2021-11-15

2、材料和方法


2.1. 材料


人血紅蛋白 (Hb) 購自 Sigma-Aldrich 並按原樣使用。 雙子表麵活性劑 乙烷-1, 2-diyl bis (N, N-二甲基-N-十六烷基乙酰氧基)二氯化物[16- E2-16]如[40]中所述合成,其結構為 如方案 1 所示。整個過程中都使用了 Millipore 水 實驗。 Hb (5 μM) 的儲備溶液在 100 mL 10 mM 磷酸鈉緩衝液 (pH 7.4) 而 16-E2-16 的儲備溶液在水中製備。 使用分光光度法測定 Hb 的濃度 280 nm 處的消光係數 118872 M-1 cm-1。


2.2. 方法


2.2.1. 表麵張力分析


表麵張力由 Delta-Pi Langmuir 測量 微張力計(Kibron,赫爾辛基,芬蘭)基於杆上的最大拉力(Du Nouy-Padday)並利用小直徑 (0.51 mm) 特殊合金線。 通過滴定法將16-E2-16加入到Hb溶液中。 樣品的值是在 298.15 K、308.15K 和 318.15K。


測量池的溫度由以下控製: Grant GD120 水溫控器。 每次溫度測量後,將合金線清洗並在酒精中幹燥 火焰。


2.2.2. 吸光度測量


吸收光譜在配備珀耳帖型溫度控製器的 Jasco-660 分光光度計中測量 (ETCS761)。 使用的蛋白質濃度為 5 μM,用於光譜 700–300 cm−1 範圍內的測量值。 使用光程長度為 1.0 cm 的池。 將 2000 μL 的 5 μM 蛋白溶液放入 放入 1.0 cm 比色皿中,並用 20 μM 儲備溶液滴定 16-E2-16。 每次滴定加入 40 μL,譜圖為 記錄。基線校正總是針對空白進行。


2.2.3. 熒光光譜測量


Trp熒光光譜和同步熒光光譜 在 Jasco 熒光分光光度計(FP-6200 型)中使用 3 mm 石英池在 25 ± 0.1 °C 下測量天然條件下的 Hb。 這 電池的溫度通過來自外部恒溫水浴的循環水來維持。 使用的蛋白質濃度 為 5 μM。 激發波長為 280 nm,發射光譜記錄在 300-400 nm 波長範圍內。 由緩衝液和表麵活性劑組成的參考樣品 檢查熒光信號。 2000 μL 操作溶液 通過連續添加 40 μL 16-E2-16 (20 μM) 儲備溶液來滴定 5 μM Hb。 滴定是通過使用手動完成的 一個微量移液器。 同步熒光光譜的波長間隔 (αl) 為酪氨酸殘基 (Tyr) 為 20 nm 和 80 nm 分別為色氨酸殘基 (Trp)。


2.2.4. 圓二色性測量


CD 光譜記錄在 Jasco-715 分光偏振計上, 配備微型計算機。 儀器已校準 (+)-10-樟腦磺酸。 所有 CD 測量值均為 使用恒溫控製的細胞架在 298K 下進行 連接到 Neslab RTE-110 水浴,精度為 ±0.1K。 蛋白質二級結構的變化是 使用 1 mm 路徑在遠紫外區域 (200–250 nm) 進行監測 長單元格。 來自含有緩衝液的參考樣品的信號 並且從所有的 CD 信號中減去去汙劑 測量。 CD 儀器定期用 D- 10-樟腦磺酸。 為了提高信噪比,在 每次掃描至少進行六次累積。 CD 數據被轉換為濃度無關參數,平均殘留量 橢圓度 [β] (deg cm2 dmol−1),使用關係式 [43]



其中 θλ 是在波長處觀察到的橢圓度(以毫度為單位) λ,M0 是蛋白質的平均殘基重量,c 是蛋白質 以克/立方厘米為單位的濃度,l 是細胞的光程長度,以厘米為單位。 222 nm 處的橢圓度值 (θ222nm/mdeg)用於計算BSA的α-螺旋含量 使用 Morrisett 等人給出的以下等式。 [44]



2.2.5. 分子對接


進行分子對接以確定蛋白質 Gemini 表麵活性劑結合親和力、結合常數以及 識別潛在的結合位點和相鄰的相互作用 Hb 和 16-E2-16 之間。 血紅蛋白的晶體結構 (PDB ID: 2D60) 來自蛋白質數據庫。 16-E2-16的結構由ChemDraw Ultra 8.0構建。 這 使用分子對接軟件 AutoDock Vina [45] 進行對接實驗。 盲對接是由 沿 x、y、z 軸將網格大小設置為 58、50、54,網格間距為 1000Å。 網格中心設置為 15.499Å、3.439Å、14.787Å。 如 AutoDock Vina 中所述使用默認參數 手動的。 總共進行了 10 次運行,然後 根據排名選擇最低能量構象異構體 得分。 分子對接結果由 PyMOL [46] 呈現。


2.2.6. 分子動力學模擬


GROMACS 5.0 軟件 [47,48] 用於進行 MD 對未結合和 16-E2-16 有界 Hb 的模擬。 建立 Hb 分子的電位,GROMOS96 43a1 力場 [49,50] 被應用。 16-E2-16的最低能量對接構象 用於MD模擬,內置拓撲參數 ProGrg 服務器 [51]。 未結合和 C16 結合的 Hb 被溶劑化 SPC 水模型 [52] 在十二麵體盒中,包含 7174 和 6587 個分子。 添加單個鈉離子 在兩個係統中以中和整個係統。 那麽能量為 兩個係統都使用 800 步最速下降進行了最小化 算法後跟水箱中的共軛梯度法,用於釋放衝突接觸。 應用了兩個最小化係統 在 300K 時達到 100 ps 的位置限製動態,其中 Hb 和 Hb-(16-E2-16)複合物通過添加抑製保持固定 然而,水分子被允許運動。 最後一步,兩個係統的 MD 模擬在 300K、1 bar 和 0.1 ps 下的等溫-等壓合奏使用 貝倫森方法。 LINCS [53] 算法用於約束鍵長,允許使用 2 fs 時間步長。 範德 瓦爾斯和庫侖相互作用在 1.2 nm 處被截斷。 MD模擬的所有分析都是使用軌跡分析工具進行的 GROMACS 軟件包。


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